毕赤酵母是一种非常受欢迎的真核表达系统，尤其适用于生产外源重组蛋白（如酶、疫苗、抗体片段等）。其发酵过程比大肠杆菌更复杂，通常分为多个 distinct 阶段，以大化蛋白产量。
毕赤酵母发酵的核心特点
1.强效诱导型启动子： 常用的是AOX1 启动子（醇氧化酶基因启动子），它能被甲醇（Methanol）强烈地诱导，同时被甘油（Glycerol）和葡萄糖严格抑制。
2.生长与生产分离： 发酵策略明确将菌体生长（使用甘油或葡萄糖）和产物表达（使用甲醇诱导）分为两个阶段，这是其工艺核心。
3.高密度发酵： 毕赤酵母能够达到非常高的细胞密度（干重超过 100 g/L），从而有望获得产物产量。
4.需严格控碳： 甲醇本身有毒且易燃，其代谢速率需要精细控制，过量会导致毒性积累和溶氧崩溃；不足则无法充分诱导表达。
经典的毕赤酵母发酵流程（三阶段策略）
下图直观地展示了毕赤酵母发酵过程中三个阶段的碳源切换、细胞生长和产物表达的典型流程：
1. 批次生长阶段（Glycerol Batch Phase）
•目标： 在富培养基中让菌体快速生长，积累生物量。
•碳源： 使用甘油（有时也用葡萄糖）。甘油既能作为碳源和能源，又能强烈抑制AOX1启动子，防止目的基因提前表达，节省细胞能量用于生长。
•过程： 接种后，酵母菌利用培养基中的甘油进行好氧生长，进入指数生长期。溶氧（DO）会因菌体消耗而下降。
•结束标志： 基础培养基中的甘油耗尽（通常伴随DO急剧回升）。
2. 甘油补料阶段（Glycerol Fed-batch Phase）
•目标： 获得高细胞密度，为后续诱导表达准备大量的“细胞工厂”。
•碳源： 持续流加高浓度甘油溶液。
•控制策略： 采用限速补料（Carbon-Limiting Feed）。将甘油流速控制在远低于菌体消耗速率的水平（例如，通过维持恒定溶氧或恒定补料速率）。
•原因： 防止甘油过量。过量甘油会导致 Crabtree 效应（即使酵母是呼吸型微生物，碳通量仍可能导致副产物积累）和AOX1启动子的抑制。
•结束标志： 菌体生物量达到预定目标。停止甘油补料后，DO会再次急剧回升，表明甘油已耗尽。
3. 甲醇诱导阶段（Methanol Induction Phase）
•目标： 诱导目的基因的表达，生产重组蛋白。
•诱导剂/碳源： 甲醇。
•过程：
•适应/过渡期： 刚开始流加甲醇时，流速非常低。因为菌体需要合成AOX1酶系来代谢甲醇，此阶段菌体代谢甲醇的能力很弱。过快的甲醇流加会导致其积累，对细胞产生毒性并抑制表达。
•诱导表达期： 随着AOX1酶系的表达，菌体代谢甲醇的能力逐渐增强。此时可逐步提高甲醇流速，直至达到菌体能完全代谢的大速率（维持一个稳定的、较低的甲醇浓度）。
•甲醇代谢耗氧量高，会导致溶氧（DO）大幅下降。通过提高搅拌转速、通气量、罐压甚至纯氧来维持DO在可用水平（通常>20-30%），否则会导致诱导失败。
•持续时间： 此阶段可持续很长时间（可达100小时以上），期间甲醇既是诱导剂，也是碳源和能源，维持菌体活力并驱动蛋白表达。
关键工艺控制参数
1.溶氧（DO）： 是关键的参数。尤其在甲醇诱导阶段，需要供氧能力。DO的波动直接反映了碳源的供需情况。
2.温度： 通常生长阶段为28-30°C。诱导阶段有时会降低温度（如20-25°C），以减缓生长速率、提高蛋白正确折叠率并减少蛋白酶降解。
3.pH： 通常用氨水（同时作为氮源和碱）和酸（如磷酸或硫酸）控制在一定范围（如pH 5.0-6.0），具体取决于表达条件。
4.甲醇浓度： 系统使用尾气分析或在线甲醇探头来监测和反馈控制甲醇流加速率，防止其积累或饥饿。
5.泡沫控制： 高密度发酵和蛋白表达会产生大量泡沫，需要机械消泡和消泡剂相结合。
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