大肠杆菌（Escherichia coli）发酵过程的详细介绍

这是一个关于大肠杆菌（Escherichia coli）发酵过程的详细介绍。大肠杆菌是生物技术和制药工业中常用、成熟的表达宿主之一，用于生产重组蛋白、疫苗、氨基酸和多种化学品。

其发酵过程通常可以分为四个主要阶段，并在不同的规模（从摇瓶到大型生物反应器）中进行，但核心原理一致。

​大肠杆菌发酵的四个典型阶段​
下图直观地展示了大肠杆菌发酵过程中四个阶段的细胞密度（OD值）、底物消耗和产物合成的典型趋势：

•​折线一（蓝色）​​：代表菌体密度（OD600），展示了延迟期后的指数增长、稳定期和衰亡期的变化。

•​折线二（红色）​​：代表底物（如葡萄糖）浓度，在指数期被快速消耗，在衰亡期已耗尽。

•​折线三（绿色）​​：代表目标产物（如重组蛋白）的浓度，主要在稳定期大量合成。

​1. 延迟期 (Lag Phase)​​
•​生理状态​： 接种后，细胞不会立即分裂。它们需要适应新的环境（如新的培养基、温度、pH）。

•​细胞活动​： 细胞吸收营养物质、合成各种辅酶、RNA和核糖体，为快速生长做准备。细胞体积增大。

•​管理点​： 此阶段的长短取决于接种物的活力和新旧培养基的差异。为了缩短延迟期，通常使用高活力、处于对数生长期的种子液，并确保接种量充足（通常1-10%的接种比例）。

​2. 指数生长期 (Exponential Growth / Log Phase)​​
•​生理状态​： 细胞适应环境后，以大速率进行分裂繁殖。细胞数量（菌体密度）呈指数级增长。

•​细胞活动​： 新陈代谢旺盛，大量消耗培养基中的碳源（如葡萄糖）、氮源、无机盐等营养物质，并产生能量（ATP）和合成细胞物质。

•​参数变化​： 溶氧（DO）水平会因菌体消耗而急剧下降；pH也可能因代谢产酸（如乙酸）而先下降后上升​（后期消耗氨基酸产氨）。

•​管理点​： 此阶段需要密切监控和控制温度、pH和DO，防止环境失衡。对于高密度发酵，通常采用补料-分批（Fed-Batch）策略，即持续缓慢添加浓缩营养物（主要是碳源），防止其过量导致“葡萄糖效应”（Crabtree effect）和乙酸（Acetate）的积累​（乙酸会抑制菌体生长和蛋白表达）。

​3. 稳定期 (Stationary Phase)​​
•​生理状态​： 细胞分裂速率与死亡速率基本相等，活菌数达到峰值并保持稳定。

•​触发原因​： 通常由营养耗尽​（如碳源、氮源限制）或有害代谢物积累​（如乙酸、有机酸）引起。

•​细胞活动​： 对于表达重组蛋白的大肠杆菌，​稳定期往往是目标产物合成的主要阶段。此时，细胞将代谢资源从生长转向产物合成。许多采用T7强启动子的表达系统（如pET载体）会在此阶段加入诱导剂（如IPTG）​，解除抑制，启动外源基因的大量转录和表达。

•​管理点​： 精确控制诱导时机（通常在OD600达到一定值时）、诱导剂浓度和诱导后的条件（温度、补料速率），以蛋白产量并减少包涵体的形成。

​4. 衰亡期 (Death / Decline Phase)​​
•​生理状态​： 细胞死亡速率超过新生速率，活菌数开始下降。

•​触发原因​： 环境严重恶化，营养匮乏，有毒物质浓度过高。

•​细胞活动​： 细胞开始裂解，可能释放蛋白酶，从而降解已表达的目标蛋白。

•​管理点​： ​确定收获时间至关重要。通常在衰亡期早期、细胞开始大量裂解前终止发酵，下游收获菌体或产物，以避免产量损失。